Human Neutrophil Isolation Kit磁珠法,AGCC-12106

产品介绍

本试剂盒是一种基于免疫磁珠分选技术的细胞分离系统，用于从人外周血或骨髓样本中快速、高效地分离高纯度的人中性粒细胞。

其原理是利用生物素标记的抗体 cocktail（抗体混合物）标记非目标细胞（如T细胞、B细胞、单核细胞、红细胞前体等），随后加入抗生物素的磁珠。通过分选柱置于磁场中时，被标记的非目标细胞结合在分选柱上，而未标记的中性粒细胞则自然流出，从而获得高纯度的目的细胞。

产品特点

-   高纯度： 分离得到的中性粒细胞纯度通常可达95%以上。

-   高活率： 分选过程温和，无需去除磁珠，对细胞激活状态影响小，细胞活力高。

-   操作简便： 无需使用密度梯度离心法（如Ficoll）预先去除红细胞，或者操作步骤极简化，耗时短（通常30-50分钟即可完成）。

-   即用型： 分选后的细胞可直接用于后续的功能学实验（如迁移、吞噬、呼吸爆发实验）、流式细胞术分析或体外培养。

使用方法（仅供参考）

注意：以下步骤需在无菌条件下操作。所有试剂使用前需恢复至室温（15-25°C）。

准备工作

1.  配制缓冲液： 如需自配，推荐配制含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 2 mM EDTA 的磷酸盐缓冲液 (PBS)，调节pH至7.2-7.4。使用前需脱气。

2.  制备单细胞悬液： 采集新鲜抗凝外周血（使用肝素钠或EDTA抗凝管）。建议使用红细胞裂解液或密度梯度离心法初步富集白细胞，但根据试剂盒说明，某些型号可直接处理全血。

分离步骤（以标准阴性分选为例）

1.  细胞计数： 确定细胞总数。将细胞悬液通过30 µm或40 µm的滤网去除细胞团块。

2.  洗涤与重悬： 300×g 离心10分钟，弃上清。每 10^7 个细胞加入 40 µL 缓冲液重悬。

3.  Fc受体阻断（若提供）： 如有FcR阻断剂，按说明书推荐量加入并混匀。

4.  标记非目标细胞：

    -   每 10^7 个细胞加入 10 µL 的 生物素标记抗体Cocktail。

    -   混匀，在 2-8°C 孵育 5-10 分钟。

5.  加入磁珠：

    -   每 10^7 个细胞加入 30 µL 缓冲液。

    -   每 10^7 个细胞加入 20 µL 的 Anti-Biotin MicroBeads。

    -   混匀，在 2-8°C 孵育 5-10 分钟。

6.  洗涤：

    -   加入 1-2 mL 缓冲液洗涤细胞，300×g 离心10分钟，弃上清。

    -   每 10^8 个细胞用 500 µL 缓冲液重悬备用。

7.  磁性分离（以LS柱为例）：

    -   将分选柱置于合适的MACS磁力架上。

    -   用 3 mL 缓冲液润洗分选柱，待液体自然流尽。

    -   将细胞悬液缓慢加入分选柱中，收集流出的液体（此即为富含中性粒细胞的组分）。

    -   用 3 mL 缓冲液清洗分选柱，连续清洗3次，收集流出的液体，合并到上述收集管中。

8.  收集细胞：

    -   将收集到的细胞悬液 300×g 离心10分钟。

    -   弃上清，根据需要加入合适的培养基或缓冲液重悬细胞，用于后续实验。

注意事项

1.  细胞活力： 起始样本应为新鲜采集的血液（最好在2-4小时内处理），样本放置过久会导致细胞活力下降和非特异性标记增加。

2.  抗凝剂选择： 推荐使用肝素钠或EDTA抗凝。避免使用肝素锂或柠檬酸钠（除非经过验证）。

3.  避免起泡： 混匀细胞时请勿剧烈震荡，以免产生气泡堵塞分选柱。

4.  温度控制： 孵育和分离过程建议在低温（2-8°C）下进行，以防止细胞激活和非特异性吞噬磁珠。

5.  去除死细胞： 如果样本中死细胞比例过高（>20%），建议在分离前使用死细胞去除试剂盒处理，否则会影响纯度。

6.  柱流速： 不要让分选柱流干。如果细胞悬液堵塞导致流速过慢，建议使用新的分选柱或将样本稀释后重新上柱。

常见问题解答

Q1: 分离得到的中性粒细胞纯度不高，或者混杂淋巴细胞/单核细胞？

A1:

    -   原因1： 抗体Cocktail用量不足或孵育时间不够。

    -   对策： 确保按照推荐比例添加抗体和磁珠，并保证孵育温度和时间。

    -   原因2： 样本中红细胞碎片或血小板过多，导致非特异性吸附。

    -   对策： 分离前使用密度梯度离心法（如Ficoll-Paque）去除红细胞和血小板。

Q2: 为什么细胞产率很低？

A2:

    -   原因1： 起始样本放置太久，中性粒细胞自发凋亡。

    -   对策： 务必使用新鲜样本。

    -   原因2： 分选柱堵塞，导致细胞无法流出。

    -   对策： 确保在加入细胞前已过滤去除团块；或者样本中红细胞裂解不充分导致粘稠度过高。

    -   原因3： 目标细胞被非特异性标记。

    -   对策： 增加洗涤步骤或使用Fc阻断剂。

Q3: 分离后的细胞是否可以立即用于功能实验？

 A3: 是的。本试剂盒采用阴性分选法，中性粒细胞未被抗体或磁珠直接接触，理论上未被激活，可直接用于趋化、ROS检测等功能实验。

Q4: 磁珠是否需要去除？

A4: 不需要。抗生物素磁珠为纳米级大小，可生物降解，不会影响后续的培养或功能检测。如需进行电子显微镜观察，建议通过阳性分选去除，但本试剂盒为阴性分选，无需去除步骤。

Q5: 分选柱流速非常慢怎么办？

A5: 这通常是细胞团块或蛋白沉淀堵塞造成的。可以将剩余样本稀释2-3倍后，使用新的分选柱重新分离。操作前务必使用30 µm滤网过滤。

产品声明
本产品仅限于科研，如需储存珍贵样本，请自行小规模尝试后大批量实验，产品售后仅限产品本身，无其他任何连带责任，请须知。

本产品仅供研究使用，不适用于临床诊断或治疗。