miRNA Extraction Kit (Spin Column)，AGMB-51007

产品介绍

本试剂盒采用经典的酚/氯仿抽提结合硅胶膜离心柱（Spin Column）技术，专门用于从动物组织、细胞、血浆、血清等多种样本中高效提取高质量的总RNA，其中包含miRNA、siRNA等小分子RNA（~18-200 nt）。

独特的裂解液配方能迅速破碎细胞并灭活RNase，确保RNA的完整性。后续的柱纯化步骤可有效去除蛋白质、基因组DNA及其他杂质，最终得到的RNA纯度高，可直接用于下游应用，如RT-qPCR、微阵列分析、Northern Blot和高通量测序等。

产品特点

1.  高效富集小RNA：可有效回收包括miRNA在内的200 nt以下的短片段RNA，得率高。

2.  纯度高，完整性好：独特的膜结合与洗脱系统，能有效去除蛋白质和盐离子，获得的RNA A260/A280比值通常在1.8-2.1之间，完整性好。

3.  快速简便：整个操作流程约在30-60分钟内完成，无需苯酚抽提和乙醇沉淀。

4.  安全可靠：最大程度减少有毒试剂（如氯仿）的接触时间，操作安全。

5.  广泛适用性：适用于多种起始材料，包括难处理的组织样本和微量样本。

使用方法（仅供参考）

实验前准备：

   将试剂盒组分室温平衡。

   根据瓶身标签说明，将指定量的无水乙醇加入到Buffer RWB浓缩液中，混匀，并在瓶身做好标记。

   所有实验操作请在RNase-free的环境中进行，佩戴手套和使用RNase-free的耗材。

   预先准备好水浴锅或金属浴，设置温度为65°C（用于洗脱）。

操作流程：

1.  样本裂解

       组织：取适量（<30 mg）组织于匀浆管中，加入1 ml Lysis Buffer RZ，充分匀浆。

       细胞：离心收集最多5x10^6个细胞，弃上清，加入1 ml Lysis Buffer RZ，反复吹打至裂解完全。

       血浆/血清：取200-400 μl 血浆/血清，加入1 ml Lysis Buffer RZ，剧烈涡旋15秒。

       将所有裂解液转移至新的RNase-free离心管中，室温静置5分钟。

2.  相分离

       向裂解液中加入200 μl 氯仿（自备），盖紧管盖，剧烈涡旋15秒，室温静置5分钟。

       4°C，12,000 rpm 离心15分钟。样品会分成三层：无色的上水相（含RNA）、中间的白色层（含DNA）和粉红色的下层有机相（含蛋白质）。

3.  RNA结合

       小心地将上层水相（约400-500 μl）转移至一个新的RNase-free离心管中，切勿吸到中间层。

       加入等体积的Buffer RWA，混匀。

       将混合液全部转移至Spin Column中，12,000 rpm 离心30秒，弃滤液。

4.  洗涤

       向柱中加入500 μl Buffer RWA，12,000 rpm 离心30秒，弃滤液。

       向柱中加入600 μl Buffer RWB（已加乙醇！），12,000 rpm 离心30秒，弃滤液。

       重复此步骤一次，共进行两次Buffer RWB洗涤。

       将空的Spin Column放回收集管，12,000 rpm 离心2分钟，以彻底去除残留乙醇。

5.  洗脱

       将Spin Column转移至一个新的RNase-free 1.5 ml 离心管中。

       打开柱盖，向硅胶膜中央悬空滴加30-50 μl RNase-Free Water。

       室温静置2分钟。

       12,000 rpm 离心2分钟，收集洗脱液。为提高RNA产量，可将收集的洗脱液重新加回离心柱，静置2分钟后再次离心。

RNA保存与检测：

   建议立即使用或置于-80°C长期保存。

   使用微量分光光度计检测RNA浓度和纯度（A260/A280）。

   使用琼脂糖凝胶电泳或Agilent Bioanalyzer检测RNA完整性。

注意事项

1.  RNase污染是RNA实验失败的首要原因！务必确保工作台、移液器、耗材无RNase污染，全程佩戴手套。

2.  氯仿有毒，操作应在通风橱内进行，并穿戴好防护装备。

3.  在吸取上清液时，宁可损失部分RNA，也绝不能吸入中间层或有机相，否则会严重污染RNA，影响下游实验。

4.  Buffer RWB在使用前必须加入指定量的无水乙醇，否则洗涤效果不佳，会导致盐离子残留。

5.  离心后务必弃尽收集管中的废液，特别是最后一次洗涤后的空离步骤，乙醇残留会抑制下游酶反应。

6.  洗脱时，使用预热的RNase-Free Water（65°C）或提高洗脱体积，可以提高最终的RNA洗脱效率。

常见问题解答

Q1: 提取的RNA A260/A280比值偏低（<1.7），是什么原因？

   可能原因1：蛋白质污染。 在相分离步骤吸到了中间层或有机相。

   可能原因2：洗涤不充分或Buffer RWB中未加乙醇。 确保按比例加入了乙醇，并进行了两次洗涤。

   可能原因3：测量时pH值影响。 RNA溶解于水中时，A260/A280比值会偏低。使用TE缓冲液（pH 8.0）溶解或测量会更准确。

Q2: RNA得率很低，可能是什么问题？

   样本量过多或裂解不充分。 确保样本量在试剂盒推荐范围内，组织需充分匀浆。

   在相分离步骤中，上清液吸取量不足。

   洗脱效率低。 尝试使用预热的洗脱液，或进行二次洗脱（将第一次洗脱液重新加回柱子再洗脱一次）。

   起始样本中RNA含量本身较低。 对于血浆/血清等微量样本，可适当增加起始体积。

Q3: 下游实验（如RT-qPCR）效果不好，可能与提取的RNA有什么关系？

   有抑制剂残留。 通常是乙醇或盐离子未洗净。确保进行了空离步骤以彻底去除乙醇。

   RNA降解。 检查实验操作过程是否引入了RNase污染，或样本本身是否新鲜。

   miRNA未被有效提取。 本试剂盒专为小RNA优化，但仍需确认下游检测方法的特异性。

Q4: 离心柱堵塞了怎么办？

   样本中含有过多杂质或基因组DNA。在将裂解液上柱前，可以先用12,000 rpm离心5分钟，取上清液进行后续操作。对于基因组DNA含量高的样本，可在裂解后增加一个DNase I 柱上消化步骤（可选配件）。

Q5: 可以用于植物样本吗？

   本试剂盒主要针对动物来源样本。植物样本含有较多的多糖和多酚，会干扰提取。建议使用专门为植物设计的RNA提取试剂盒。

产品声明
本产品仅限于科研，如需储存珍贵样本，请自行小规模尝试后大批量实验，产品售后仅限产品本身，无其他任何连带责任，请须知。

本产品仅供研究使用，不适用于临床诊断或治疗。