ELISA Kit for Corticosterone,AGEA-G054

INTENDED USE

The kit is a competitive inhibition enzyme immunoassay technique for the in vitro quantitative measurement of corticosterone in serum, plasma, urine and other biological fluids.

REAGENTS AND MATERIALS PROVIDED

MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED

1.    Microplate reader with 450 ± 10nm filter.

2.   Single or multi-channel pipettes with high precision and disposable tips.

3.    Microcentrifuge Tubes.

4.    Deionized or distilled water.

5.   Absorbent paper for blotting the microplate.

6.   Container for Wash Solution.

7.   0.01mol/L (or 1 ×) Phosphate Buffered Saline(PBS), pH7.0-7.2.

STORAGE OF THE KITS

1.    For unopened kit: All the reagents should be kept according to the labels on vials. The Standard, Detection Reagent A, Detection Reagent B and the 96-well strip plate should be stored at -20oC upon receipt while the others should be at 4oC.

2.    For used kit: When the kit is used, the remaining reagents need to be stored according to the above storage condition.  Besides,  please  return the  unused wells to the foil  pouch containing the desiccant  pack, and zip-seal the foil pouch.

Note:

It is highly recommended to use the remaining reagents within 1 month provided this is prior to the expiration date of the kit. For the expiration date of the kit, please refer to the label on the kit box. All components are stable up to the expiration date.

SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

Serum - Use a serum separator tube and allow samples to clot for two hours at room temperature or overnight at 4oC  before  centrifugation  for  20  minutes  at  approximately   1,000 ×g.  Assay   freshly  prepared  serum immediately or store samples in aliquot at -20oC or -80oC for later use. Avoid repeated freeze/thaw cycles.

Plasma - Collect  plasma  using  EDTA or  heparin  as an anticoagulant. Centrifuge samples for  15  minutes  at 1,000 ×g at 2-8oC within 30 minutes of collection. Remove plasma and assay immediately or store samples in aliquot at -20oC or -80oC for later use. Avoid repeated freeze/thaw cycles.

Urine - Aseptically collect the first urine of the day (mid-stream), voided directly into a sterile container. Centrifuge to remove particulate matter, assay immediately or aliquot and store at  ≤-20oC. Avoid repeated freeze-thaw cycles.

Other  biological fluids  -  Centrifuge samples for 20  minutes  at  1,000 ×g.  Collect  the supernates  and assay

immediately or store samples in aliquot at -20oC or -80oC for later use. Avoid repeated freeze/thaw cycles.

Note:

1.    Samples to be used within 5 days may be stored at 4oC, otherwise samples must be stored at -20oC (≤ 1 month) or -80oC (≤2 months) to avoid loss of bioactivity and contamination.

2.   Sample hemolysis will influence the result, so hemolytic specimen should not be used.

3.   When performing the assay, bring samples to room temperature.

4.    It is highly recommended to use serum instead of plasma for the detection based on quantity of our in-house data.

REAGENT PREPARATION

1.    Bring all kit components and samples to room temperature (18-25oC) before use. If the kit will not be used up in one time, please only take out strips and reagents for present experiment, and leave the remaining strips and reagents in required condition.

2.     Standard  -  Reconstitute  the  Standard  with  1.0mL  of  Standard  Diluent,  kept  for  10  minutes  at  room temperature, shake gently(not to foam). The concentration of the standard in the stock solution is 500ng/mL. Please prepare 5 tubes containing 0.6mL Standard Diluent and produce a triple dilution series according to the  picture shown  below.  Mix  each  tube thoroughly  before the  next transfer.  Set  up  5  points  of diluted standard such as 500ng/mL, 166.67ng/mL, 55.56ng/mL, 18.52ng/mL, 6.17ng/mL, and the last EP tubes with Standard Diluent is the blank as 0ng/mL.

3.     Detection  Reagent A and  Detection  Reagent  B  -  Briefly  spin or centrifuge the stock  Detection A and Detection B before use.  Dilute them to the working concentration  100-fold with Assay Diluent A and B, respectively.

4.    Wash Solution - Dilute 20mL of Wash Solution concentrate (30×) with 580mL of deionized or distilled water to prepare 600mL of Wash Solution (1×).

5.    TMB substrate - Aspirate the needed dosage of the solution with sterilized tips and do not dump the residual solution into the vial again.

Note:

1.    Making serial dilution in the wells directly is not permitted.

2.    Prepare standard within 15 minutes before assay. Please do not dissolve the reagents at 37oC directly.

3.    Detection Reagent A and B are sticky solutions, therefore, slowly pipette them to reduce the volume errors.

4.    Please carefully reconstitute Standards or working Detection Reagent A and B according to the instruction, and avoid foaming and mix gently until the crystals are completely dissolved. To minimize imprecision caused by pipetting, use small volumes and ensure that pipettors are calibrated. It is recommended to suck more than 10μL for one pipetting.

5.   The reconstituted Standards, Detection Reagent A and Detection Reagent B can be used only once.

6.    If crystals have formed in the Wash Solution concentrate (30×), warm to room temperature and mix gently until the crystals are completely dissolved.

7.   Contaminated water or container for reagent preparation will influence the detection result.

SAMPLE PREPARATION

1.   We are only responsible for the kit itself, but not for the samples consumed during the assay. The user should calculate the possible amount of the samples used in the whole test. Please reserve sufficient samples in advance.

2.    Please predict the concentration before assaying. If values for these are not within the range of the standard curve, users must determine the optimal sample dilutions for their particular experiments. Sample should be diluted by PBS.

3.    If the samples are not indicated in the manual, a preliminary experiment to determine the validity of the kit is necessary.

4.   Tissue or cell extraction samples prepared by chemical lysis buffer may cause unexpected ELISA results due to the impacts from certain chemicals.

5.    Due to the possibility of mismatching between antigen from other origin and antibody used in our kits (e.g., antibody targets conformational epitope  rather than linear epitope), some  native or recombinant  proteins from other manufacturers may not be recognized by our products.

6.     Influenced  by  the factors  including cell viability, cell number or sampling time, samples from cell culture supernates may not be detected by the kit.

7.    Fresh samples without long time storage is recommended for the test. Otherwise, protein degradation and denaturalization may occur in those samples and finally lead to wrong results.

ASSAY PROCEDURE

1.    Determine wells for diluted standard, blank and sample. Prepare 5 wells for standard points, 1 well for blank. Add 50μL each of dilutions of standard (read Reagent Preparation), blank and samples into the appropriate wells, respectively. And then add 50μL of Detection Reagent A to each well immediately. Shake the plate gently (using a microplate shaker is recommended). Cover with a Plate sealer. Incubate for 1 hour at 37oC. Detection Reagent A may appear cloudy. Warm to room temperature and mix gently until solution appears uniform.

2.     Aspirate  the  solution  and  wash  with  350μL  of  1X  Wash  Solution  to  each  well  using  a  squirt  bottle, multi-channel pipette, manifold dispenser or autowasher, and let it sit for 1-2 minutes. Remove the remaining liquid from all wells completely by snapping the plate onto absorbent paper. Repeat 3 times. After the last wash, remove any remaining Wash Buffer by aspirating or decanting.  Invert the plate and blot it against absorbent paper.

3.    Add  100μL  of  Detection  Reagent  B working solution to each well.  Incubate for 30  minutes at 37oC after covering it with the Plate sealer.

4.    Repeat the aspiration/wash process for total 5 times as conducted in step 2.

5.    Add 90μL of Substrate Solution to each well. Cover with a new Plate sealer. Incubate for 10 - 20 minutes at 37oC (Don't exceed 30 minutes). Protect from light. The liquid will turn blue by the addition of Substrate Solution.

6.    Add 50μL of Stop Solution to each well. The liquid will turn yellow by the addition of Stop solution. Mix the liquid by tapping the side of the plate. If color change does not appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.

7.    Remove any drop of water and fingerprint on the bottom of the plate and confirm there is no bubble on the surface of the liquid. Then, run the microplate reader and conduct measurement at 450nm immediately.

Note:

1.    Assay preparation: Keep appropriate numbers of wells for each experiment and remove extra wells from microplate. Rest wells should be resealed and stored at -20oC.

2.    Samples or reagents addition ：Please use the freshly prepared Standard. Please carefully add samples to wells and mix gently to avoid foaming. Do not touch the well wall. For each step in the procedure, total dispensing time for addition of reagents or samples to the assay plate should not exceed 10 minutes. This will ensure equal elapsed time for each pipetting step, without interruption. Duplication of all standards and specimens,  although  not  required,  is  recommended.  To  avoid  cross-contamination,  change  pipette  tips between additions of standards, samples, and reagents. Also, use separated reservoirs for each reagent.

3.      Incubation:  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  during  incubation  steps  is necessary.  Do  not  allow  wells  to  sit  uncovered  for  extended  periods  between  incubation  steps.  Once reagents are added to the well strips, DO NOT let the strips DRY at any time during the assay. Incubation time and temperature must be controlled.

4.    Washing:  The wash  procedure  is  critical.  Complete  removal of liquid at each step is essential for good performance. After the  last wash,  remove any  remaining Wash  Solution  by  aspirating or decanting  and remove any drop of water and fingerprint on the bottom of the plate. Insufficient washing will result in poor precision and false elevated absorbance reading.

5.    Controlling of reaction time: Observe the change of color after adding TMB Substrate (e.g. observation once every 10 minutes), if the color is too deep, add Stop Solution in advance to avoid excessively strong reaction which will result in inaccurate absorbance reading.

6.   TMB Substrate is easily contaminated. Please protect it from light.

7.     The  environment   humidity  which  is  less  than  60%  might  have  some  effects  on  the  final  performance, therefore, a humidifier is recommended to be used at that condition.

TEST PRINCIPLE

This assay employs the competitive inhibition enzyme immunoassay technique. A monoclonal antibody specific to corticosterone has been pre-coated onto a microplate. A competitive inhibition reaction is launched between biotin labeled corticosterone and unlabeled corticosterone (Standards or samples) with the pre-coated antibody specific to corticosterone. After  incubation the  unbound  conjugate  is washed  off.  Next,  avidin  conjugated  to Horseradish  Peroxidase  (HRP)  is added to each  microplate well and  incubated. The amount of bound  HRP conjugate  is  reverse  proportional  to  the  concentration  of  corticosterone  in  the  sample.  After  addition  of the substrate solution, the intensity of color developed is reverse proportional to the concentration of corticosterone in the sample.

CALCULATION OF RESULTS

This assay employs the competitive inhibition enzyme immunoassay technique, so there is an inverse correlation between corticosterone concentration in the sample and the assay signal intensity.

Average the duplicate readings for each standard, control, and samples. Create a standard curve on log-log or semi-log graph paper, with the log of corticosterone concentration on the y-axis and absorbance on the x-axis. Draw the best fit straight line through the standard points and it can be determined by regression analysis. Using some plot software, for instance, curve expert  1.30, is also recommended. If samples have been diluted, the concentration read from the standard curve must be multiplied by the dilution factor.

TYPICAL DATA

In  order to  make  the  calculation  easier, we  plot  the  O.D.  value  of the  standard  (X-axis)  against  the  log  of concentration of the standard (Y-axis), although concentration is the independent variable and O.D. value is the dependent variable. The  O.D. values  of the  standard  curve  may  vary  according  to the  conditions  of assay performance  (e.g.  operator,  pipetting technique, washing technique  or temperature  effects). Typical standard curve below is provided for reference only.

DETECTION RANGE

6.17-500ng/mL.  The   standard  curve  concentrations  used  for  the   ELISA’s  were   500ng/mL,   166.67ng/mL, 55.56ng/mL, 18.52ng/mL, 6.17ng/mL.

SENSITIVITY

The minimum detectable dose of corticosterone is typically less than 2.60ng/mL.

The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection (LLD) was defined as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.  It was determined by subtracting two standard deviations to the mean optical density value of twenty zero standard replicates and calculating the corresponding concentration.

SPECIFICITY

This assay has high sensitivity and excellent specificity for detection of corticosterone.

No significant cross-reactivity or interference between corticosterone and analogues was observed.

Note:

Limited by current skills and knowledge, it is impossible for us to complete the cross- reactivity detection between corticosterone and all the analogues, therefore, cross reaction may still exist.

RECOVERY

Matrices listed below were spiked with certain level of corticosterone and the recovery rates were calculated by comparing the measured value to the expected amount of corticosterone in samples.

LINEARITY

The linearity of the kit was assayed by testing samples spiked with appropriate concentration of corticosterone and their serial dilutions. The results were demonstrated by the percentage of calculated concentration to the expected.

PRECISION

Intra-assay Precision (Precision within an assay): 3 samples with low, middle and high level corticosterone were tested 20 times on one plate, respectively.

Inter-assay Precision (Precision between assays): 3 samples with low, middle and high level corticosterone were tested on 3 different plates, 8 replicates in each plate.

CV(%) = SD/meanX100 Intra-Assay: CV<10%     Inter-Assay: CV<12%

STABILITY

The stability of ELISA kit is determined by the loss rate of activity. The loss rate of this kit is less than 5% within the expiration date under appropriate storage condition.

To  minimize  extra  influence  on  the  performance,  operation  procedures  and  lab  conditions,  especially  room temperature, air humidity, incubator temperature should be strictly controlled. It is also strongly suggested that the whole assay is performed by the same operator from the beginning to the end.

ASSAY PROCEDURE SUMMARY

1. Prepare all reagents, samples and standards;

2. Add 50μL standard or sample to each well.

And then add 50μL prepared Detection Reagent A immediately. Shake and mix. Incubate 1 hour at 37oC;

3. Aspirate and wash 3 times;

4. Add 100μL prepared Detection Reagent B. Incubate 30 minutes at 37oC;

5. Aspirate and wash 5 times;

6. Add 90μL Substrate Solution. Incubate 10-20 minutes at 37oC;

7. Add 50μL Stop Solution. Read at 450 nm immediately.

IMPORTANT NOTE

1.    Limited by the current conditions and scientific technology, we can't completely conduct the comprehensive identification and analysis on the raw material provided by suppliers. So there might be some qualitative and technical risks to use the kit.

2.    The final experimental results will be closely related to validity of the products, so the kit should be used prior to the expiration date. And please store the kits exactly according to the instruction.

3.    Kits from different batches may be a little different in detection range, sensitivity and color developing time. Please perform the experiment exactly according to the instruction attached in kit while electronic ones from our website is only for reference.

4.    Do not mix or substitute reagents from one kit lot to another. Use only the reagents supplied by manufacturer.

5.    Protect all reagents from strong light during storage and incubation. All the bottle caps of reagents should be covered  tightly  to  prevent  the  evaporation  and  contamination  of  microorganism.  TMB  Substrate  should remain colorless till it is reacted with the enzyme which binds to the microplate.

6.    There may be some foggy substance in the wells when the plate is opened at the first time. It will not have any effect on the final assay results. Do not remove microplate from the storage bag until needed.

7.    Wrong operations during the reagents preparation and loading, as well as incorrect parameter setting for the plate reader may lead to incorrect results. A microplate reader with a bandwidth of 10nm or less and an optical  density   range  of  0-3   O.D.  at  450   ±   10nm  wavelength   is  acceptable  for   use  in  absorbance measurement. Please read the instruction carefully and adjust the instrument prior to the experiment.

8.   Variation in sample preparation and each step of experimental operation may cause different results. In order to get better reproducible results, the operation of each step in the assay should be controlled.

9.    Each kit has been strictly passed Q.C test. However, results from end users might be inconsistent with our in-house data due to some unexpected transportation conditions or different lab equipments.  Intra-assay variance among kits from different batches might arise from above factors, too.

10.  Kits  from  different  manufacturers  with  the  same  item  might  produce  different  results,  since  we  haven’t compared our products with other manufacturers.

11. The standard of the kit and immunogen used for antibody preparation are commonly recombinant proteins, as different  fragments,   expression  systems,  purification  methods  might  be  used  in  recombinant  protein preparation, we can not guarantee the kit could detect recombinant protein from other companies. So, it is not recommended to use the kit for the detection of recombinant protein.

12. Please predict the concentration of target molecules in samples, or arrange a preliminary experiment, it is a good way to solve specific problem, e.g. the concentration of samples are beyond the detection range of the kit.

13. The kit might not be suitable for detection of samples from some special experiment, for instance, knock-out experiments, due to their uncertainty of effectiveness.

14. The instruction manual is also for the kit of 48T, but all reagents of 48T kit are reduced by half.

15. The kit is designed for research use only, we will not be responsible for any issue if the kit was used in clinical diagnostic or any other procedures.

PRECAUTION

The Stop Solution suggested for use with this kit is an acid solution. Wear eye, hand, face, and clothing protection when using this material.

TROUBLE SHOOTING