产品详情
【产品简介】
Augene Tech 膜蛋白提取试剂盒适用于从细胞、组织样品中提取膜蛋白，含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组份，包括细胞质膜、核膜和各种细胞器膜。提取过程简单方便，耗时较短。本试剂盒所提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白，下游应用范围广，提取液裂解细胞的能力较温和，需要根据实际样本情况优化裂解时间。提取的蛋白可用于 SDS-PAGE、Western Blot、IP、ELISA 实验，提取的蛋白经过脱盐后，可以直接进行转录活性分析、Gel shift 凝胶阻滞实验、蛋白质检测分析、酶活检测等下游蛋白研究实验，也可作为小型色谱柱纯化、蛋白层析纯化的原料使用。
本试剂盒的所有组份不含强离子型去垢剂成分，不会破坏蛋白的天然结构，不干扰蛋白之间相互作用的影响。本试剂盒不含有 EDTA，同时对金属螯和层析、分子筛、离子交换等层析纯化没有影响。
推荐的蛋白浓度测定方法为：BCA 法、Lowry 法。（试剂中含有少量去污剂，会干扰 Bradford 法的组份，可能导致定量结果有偏差。）如果已经进行过透析、脱盐处理更换缓冲液，则可以用于多种定量方法。
【产品特点】
1. 操作简便：步骤简单，易提取，使用方便；
2. 快速高效：大部分样品蛋白可以在使用前进行快速制备；
3. 稳定性好：包含特定的蛋白稳定剂成份，蛋白稳定性好；
4. 得率高：提取的蛋白无需进行浓缩即可直接用于 SDS-PAGE 检测；
5. 完整性好：包含多种独立的蛋白酶抑制剂，可抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等几乎所有重要的蛋白酶活性，有效保护蛋白完整性。
【储存条件】
- 试剂 A（膜蛋白提取液） ：2-8℃ 保存。
- 试剂 B（膜蛋白溶解液） ：-20℃ 保存。
- 试剂 C（磷酸酶抑制剂混合物）：-20℃ 避光保存。未开盖使用前也可 2-8℃ 储存，开盖使用后请置于 -20℃。
- 有效期：按上述条件保存，有效期 1 年。
- 运输：冰袋运输，收货后立即按各组分要求存放。
- 注意事项：蛋白酶抑制剂在 2-8℃ 低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或 37℃ 短时间水浴，变成液体状态后，将盖和管内壁上的微量液体离心至管底后，再开盖使用。试剂拆封后请尽快使用完。
【产品组成】
本试剂盒由试剂A膜蛋白提取液 25 mL、试剂B膜蛋白溶解液 10 mL 及试剂C磷酸酶抑制剂混合物 100 μL 组成，其中试剂 A 于 2-8℃ 保存，试剂 B 及试剂 C 于 -20℃ 避光保存。
【自备材料】
- 离心机、振荡器/混匀器、匀浆器/研磨杵、冰盒、移液器、离心管、吸头；
- PBS 缓冲液、蛋白定量试剂盒（BCA 法或 Lowry 法）。
【使用说明】
1、使用前准备
（1）提取液准备：
- 每 500 μL 冷的试剂 A 中加入 1 μL 试剂 C，混匀后置冰上备用。
- 每 500 μL 试剂 B 中加入 1 μL 试剂 C，混匀后置冰上备用。
（2）注意事项：
- 蛋白酶抑制剂混合物不可以一次性全部加入，需要根据样品数量准备提取液，加入对应比例的抑制剂。
- 已添加抑制剂的提取液可 4℃ 存放 3-5 天；超过 5 天，下次使用还需单独添加。
- 特殊实验需求可参考注意事项进行调整。
2、样品前处理
为方便后续蛋白提取操作，获得高质量的蛋白，实验前需对不同样品进行前处理：
- 血、液体样品：无需进行前处理；
- 细胞、细胞器样品：需离心去除培养基和保存液；
- 器官组织、植物叶片：用剪刀剪成 2-3 cm 小块；
- 角质、骨组织等坚硬样品：采用机械方法破碎成小块；
- 植物根、茎、种子、果实：采用物理方法处理成小块。
3、细胞膜蛋白提取
（1） 取 5-10×10⁶ 个细胞，在 4℃，500×g 条件下离心 3-5 min，吸干培养基，收集细胞。
（2） 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
（3）细胞样品中加入 500 μL 冷的试剂 A（含试剂 C），充分混匀。
（4） 在 2-8℃ 条件下振荡 30 min，至细胞充分裂解，细胞沉淀明显减少。
（5） 在 4℃，12000×g 条件下离心 5 min。
（6） 将上清吸入另一预冷的干净离心管，37℃ 水浴 10 min。在 37℃，1000×g 离心 5 min，此时溶液分为两层。
（7） 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。
（8） 用 100-200 μL 冰的试剂 B（含试剂 C）充分溶解下层膜蛋白部分，即得膜蛋白。
4、组织膜蛋白提取
（1） 取 50-100 mg 组织样本，用冷 PBS 洗干净，用手术剪刀剪碎。
（2） 加入 500 μL 冷的试剂 A（含试剂 C），用组织匀浆机/器匀浆至无明显肉眼可见固体。
（3） 将组织匀浆吸入预冷的干净离心管中，在 4℃ 条件下振荡 30 min。
（4） 按照细胞膜蛋白提取步骤 5-8 继续操作。
5、蛋白定量与保存
（1）将提取的膜蛋白用 BCA 法或 Lowry 法进行蛋白定量。
（2）分装后于 -80℃ 保存备用，或直接用于下游实验。
【注意事项】
1. 仅限科研使用，不得用于临床诊断或治疗。
2. 珍贵样本实验前，建议先做预实验，优化实验条件，取得最佳提取效果。
3. 实验过程中的所有试剂须预冷，整个过程须保持样品处于低温。
4. 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
5. 蛋白丰度低时，可增加样本处理用量，延长裂解时间和振荡时间来充分裂解样品。
6. 裂解液粘稠：属于正常现象，证明裂解比较充分。如出现胶状不溶解小块，为大量基因组聚集所致，常规实验可离心取上清即可。如需检测与基因组结合特别紧密的蛋白，可进行超声处理（推荐条件：功率 100-300 W，超声 5-10 s，间隔 10 s，处理 3 min），再离心取上清。
7. SDS-PAGE 电泳背景高、条带扭曲：可适当稀释样品，过高浓度的蛋白会在凝胶孔隙中沉积，阻塞电泳缓冲液的流动。
8. 蛋白析出：提取的蛋白后续出现析出情况，需重新制备并低温保存。若后续不检测蛋白天然结构和活性，可用含变性剂成份试剂溶解沉淀和稀释样品（如 β-ME、DTT、尿素、盐酸胍等）。
9. 样品使用前请检查是否存在析出或浑浊情况，若有析出可短暂 37℃ 水浴溶解后使用；若出现污染情况，请停止使用。
10. 蛋白酶抑制剂为非必需添加成份：如有特殊要求且不进行长期保存，可不添加。若进行特定蛋白酶活性检测，提取液不加抑制剂，需注意保持低温、缩短离心时间；固定组织、干组织等特殊样本，不用于相关蛋白活性检测的，无需使用抑制剂。
11. 使用过程中注意避免皮肤或粘膜与试剂直接接触。
12. 试验后样品及器皿按照规定程序处理。